1. 研究目的与意义
内容：乳腺癌是女性致死率最高的肿瘤，在40-50岁女性中，超过四分之一的女性在乳腺中存在原位良性结节。然而在这个年龄区间内，只有不足1%的女性被诊断出患有乳腺癌。并非所有的原位乳腺肿瘤都能发展成为癌症，究竟是什么机制唤醒休眠肿瘤引发人们的思考。组织凝血因子III（TF）是一种分子量为47KD的跨膜蛋白。起初因其重要的促凝血功能被发现，其通过胞外区的结构可与配体因子VII或VIIa结合，发挥蛋白质水解活性，活化包含凝血酶在内的一系列凝血因子，从而快速地启动凝血级联反应产生大量纤维蛋白，同时激活血液中血小板使其发挥黏附、聚集功能，在富含纤维蛋白区域形成血块，导致血栓的形成。但是多项研究通过原位杂交技术表明:TF的表达水平与肿瘤细胞侵袭能力呈正相关。TF启动肿瘤血管生成开关功能的发挥与其蛋白结构紧密相关，其调控肿瘤血管生成的作用，主要依靠细胞膜内结构域，并通过蛋白酶激活受体2信号通路向下游传递。基于TF与肿瘤恶性的相关性，本研究拟选定TF高表达的人源乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向敲除TF，并运用PCR、Western Blot等分子生物学实验方法分别从基因水平、蛋白水平去验证敲除效率，最后通过划痕法在细胞水平检测TF基因敲除后乳腺癌细胞迁移能力的改变，并结合matrigel plug实验，在动物水平实验去验证TF基因敲除对乳腺癌血管生成开关的调控作用，从而确立TF与乳腺癌恶性的相关性。
2. 文献综述
CRISPR基因编辑技术在医药领域的相关应用
摘 要: CRISPR（clustered regularly interspersed short palindromic repeats）是一种新型基因编辑技术,可以通过对基因进行精准修饰来达到治疗肿瘤、研究新型药物的目的。本文主要综述了基因编辑技术的发展历史、三种不同基因编辑技术的优缺点比较、CRISPR技术的工作原理、CRISPR在药物研究中的应用及CRISPR技术目前存在的问题等，为更好地挖掘出CRISPR/Cas9在医药领域的应用潜力提供参考。
关键词： CRISPR；基因；肿瘤；CRISPR/Cas；药物研发；基因编辑
Related applications of CRISPR gene editing technology in the field of medicine
Abstract: CRISPR (clustered regular interspersed short palindromic repeats) is a novel gene editing technology that can achieve the purpose of treating tumors and researching new drugs by precisely modifying genes. This paper mainly reviews the development history of gene editing technology, the advantages and disadvantages of three different gene editing technologies, the working principle of CRISPR technology, the application of CRISPR in drug research and the existing problems of CRISPR technology, in order to better dig out The reference potential of CRISPR/Cas9 in the field of medicine.
Key Words：CRISPR；Gene；Oncology；CRISPR/Cas；Drug Development；Gene Editing
1. 什么是CRISPR?
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，简单来说就是细菌为了抵抗病毒等外来基因的入侵，其自身进化出了一种系统，细菌利用这个系统可以将病毒基因从自己的染色体上切除，从而达到保护自身的目的。我们将细菌这种特有的免疫系统称之为CRISPR。科学家们尝试利用细菌的这一特征来治疗由致病基因产生的相关疾病。
2. 基因编辑技术的发展历史
基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。科学家们对基因编辑技术的研究已经有30年左右的时间了，整个基因编辑技术可以分为三代，第一代：人工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）；第二代：转录激活因子样效应物核酸酶（TELEN）；第三代：RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术（CRISPR）。从1996 ZFN的首次出现到2013 CRISPR的问世。毫不夸张的讲，每一次基因编辑技术的出现，都引起无数科研学者的高度关注和浓厚兴趣。
3.三种基因编辑技术的比较
ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷严重制约了该技术的推广:第一，设计高亲和性的 ZFN往往需要投入大量的工作和时间，大大地增加了技术成本;第二、在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;第三、虽然已建有ZFN库，该技术能识别多种DNA序列，但不能达到识别任意靶DNA，所以它的应用在一定程度上依旧受到限制。作为第二代基因编辑技术，TALEN的成本要比ZFN便宜得多、技术难度大大降低及设计性更强。TALEN的不足之处在于TALEN 分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作。这大大限制了这项技术的应用。相比于ZFN与TALEN等以往的基因编辑技术，CRISPR作为最新一代基因编辑技术具有无法替代的优势，包括良好的特异性、可用位置更多、使用范围广、更具有可拓展性、使用方便、步骤简单、成本低廉等[1]。但CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性，即该技术可以发生非特异性切割，使基因组非靶向位点发生突变，这会造成研究结果的不确定性以及增加研究难度和工作强度，这些问题严重地限制了CRISPR/Cas9的应用[2]。目前，科研人员正在研究解决CRISPR脱靶性的问题并已取得了一些进展。总的来说，三种基因编辑技术各有优缺点，虽然CRISPR在这三种基因编辑技术当中存在显著优势，但ZFN 和TALEN 仍然具有广阔的应用前景。我将三种不同的基因编辑技术用表格的方式进行比较（如表1）。
表1 三种不同基因组编辑技术比较 | |||
ZFN | TALEN | CRISPR | |
识别模式 | 蛋白质-DNA | 蛋白质-DNA | RNA-DNA |
识别序列 | 以3bp为单位 | 5前一位为T | 3序列为NGG |
特异性 | 较高 | 一般 | 一般 |
构建难易 | 难度大 | 较容易 | 容易 |
细胞毒性 | 大 | 较小 | 较小 |
技术难度 | 困难 | 较容易 | 非常容易 |
脱靶效应 | 较轻 | 较轻 | 较严重 |
4.CRISPR/Cas9 的工作原理
当细菌抵御噬菌体等外源 DNA 入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的 RNA 前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA[3]。通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA )，引导Cas9对DNA的定点切割[4]。其工作原理[5]如图1所示：
图1 CRISPR的工作原理示意图（本图摘自信欣，陈丽杰，薛闯.CRISPR/Cas9技术在细菌中的研究进展及应用[J].微生物学杂志.2018年12月第38卷第6期）
5.CRISPR在医药领域的相关应用
5.1 CRISPR/Cas9 技术在肿瘤研究中的应用
研究人员利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外构建了新的嵌合抗原受体修饰 T 细胞，这种细胞可被精确定位到特异位点上。利用这一特性，科学家们可以很好的达到基因调控的目得。肿瘤细胞要生长发展就必须逃避机体免疫细胞的监测，使体内的抑癌基因不对其造成攻击，因此肿瘤细胞往往会使机体免疫细胞失效。通过利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术改造机体免疫细胞，恢复免疫细胞的识别功能从而达到重新特异性识别肿瘤细胞的目的，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术逃避机体免疫识别将可能成为肿瘤免疫疗法的新方向[6]。CRISPR基因编辑技术在肿瘤研究中的应用目前还主要停留在动物模型上，但是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在小鼠肿瘤模型构建上的应用和已取得的一些进展。我相信CRISPR/Cas9基因编辑技术将为肿瘤治疗带来新的契机。
由于 CRISPR/Cas9系统具有构造简单和操作便捷的优点，科学家们已经尝试将CRISPR 系统创造性地应用于癌症的研究中。通过将 DNA 测序和CRISPR/Cas9介导的基因敲除相结合，研究基因功能的缺失与肿瘤生长和转移的表型间的相关性，我们可以了解癌症的基因是由哪些表型所导致的[7]。2015年，Brandon等[8]首次将CRISPR技术应用到了癌症相关的基因治疗研究，他们设计了一种慢病毒载体使 CRISPR 系统可以被doxycycline 进行诱导表达，并高效地对细胞进行编辑。应用这个系统，他们实现了对 MCL-1 基因在体内和体外的敲除。MCL-1 基因是人淋巴瘤细胞系生长所必须的，当这个基因被敲除后，癌症细胞出现了明显的死亡。这说明癌症细胞的存活与某些基因的存在有一定的联系。CRISPR 系统的应用不仅为癌症研究提供了新的技术手段，更为我们提供了癌症研究的新方法。此外，用 CRISPR/ Cas9 技术靶向编码蛋白功能结构域的外显子造成突变, 可对维持癌细胞生长存活及发育等过程具有重要作用的蛋白或结构域进行大规模筛选, 这对寻找合适的药物作用靶点及开发癌症治疗药物具有重要意义。
5.2 CRISPR/Cas9系统在人眼相关疾病中的应用
全球每年患有视网膜退行性疾病的人数很多且视网膜再生的可能性很小，如何运用有效手段解决视网膜退行性疾病已然成为医学工作者面临的重大问题。尤其是面对遗传性视网膜退行性疾病患者，其基因突变的形式具有多样性和复杂性，这大大增加了治疗的难度。据最新数据统计目前全球有2000多万遗传性视网膜疾病的患者还没有接受可靠有效的治疗，他们都将面临失明的风险。随着基因编辑技术的发展，基因编辑技术有望为这类疾病提供新的治疗方案。研究者们正尝试利用CRISPR/Cas9 系统研究与视网膜退行性疾病有关的基因[9]。通过CRISPR/Cas9系统，科学家们可以对与视网膜退行性疾病有关的基因进行定点切除与修复，从而达到治疗眼部疾病的目的。CRISPR/Cas9 系统在人眼相关疾病中的应用前景将是十分光明的。
5.3 CRISPR/Cas9技术在药物研发中的应用
药物的研发工作需要经历一系列的流程，其中药物靶点的筛选与鉴定是所有工作的开始, 而这往往需要巨大的投入。因此, 药物研发需要一个良好的药物靶点的发现与验证的平台。过去科学家们常常选用RNA干扰技术 (RNAi) ，因为这项技术能够大大缩短筛选药物靶标和先导化合物的时间。此外，利用这项技术可以精确且高效地靶向靶基因的 mRNA, 抑制靶基因表达。但 RNAi 技术也存在很大的弊端,尤其是重现性差和脱靶效应较严重，有时甚至会导致完全错误的结果。CRISPR/Cas9的出现则为研究者提供了一个新的选择。目前CRISPR/Cas9 因其强大的基因编辑功能, 已被广泛用于功能基因的筛选和编辑、药物靶点的筛选与验证、动物模型的构建等多项领域,为新型药物研发或先导化合物的开发奠定了良好的基础。
6. CRISPR /Cas9技术目前存在的问题
CRISPR /Cas9 技术可以通过对致病基因的改造达到疾病治疗的目的，但是在其应用于临床之前，我们需要进一步提高基因编辑的效率和精确度、CRISPR /Cas9系统的特异性及解决CRISPR /Cas9的潜在脱靶性问题。为了实现高效精准基因编辑，研究人员还需通过改变同源模板的形式、长度以及递送方式，不断优化CRISPR /Cas9系统的作用条件。此外，研究者还需要改善CRISPR /Cas9在体内的传递系统，尝试在体外条件下高效编辑多种组织细胞类型的方法，将CRISPR /Cas9技术逐步应用到临床医学上[10]。此外，CRISPR /Cas9也激发了科学家们对人类伦理问题的剧烈讨论，各国政府正在出台相应的法规来规避可能存在的风险。
7.结语
CRISPR作为第三代基因编辑技术，在技术上与第一代和第二代基因编辑技术有很大改进。可以帮助科学工作者对特定基因进行编辑改造，如进行突变、敲除，或进行基因的定点整合等，为分子生物学技术进行基因功能研究、物种改良与改造提供了机遇和条件[11]。更值得欣喜的是它为一些传统手段难以治疗的疾病带来了希望。在器官移植领域、病毒类疾病以及遗传类疾病方面，该技术已有了明显的突破，这对患者来说是巨大的福音。近年来有关CRISPR的论文数量每年都呈现出大幅度的上升趋势，这说明CRISPR具有巨大的潜力和广阔的应用前景。
参考文献
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[2]张梦娜，柯丽萍，孙玉强.基因编辑新技术最新进展[J].中国细胞生物学学报. 2018, 40(12): 20982107
[3]谢亚磊，刘千琪，刘戟.CRISPR/Cas9基因编辑技术最新研究进展[J].生命的化学, 2016, 36(1): 1-6
[4]李君红，张富婷，桑春艳，王晓辉，惠 玲. CRISPR基因编辑技术在肿瘤研究中的应用[J].解放军医药杂志.2015 年9月第27卷第9期
[5]信欣，陈丽杰，薛闯.CRISPR/Cas9技术在细菌中的研究进展及应用[J].微生物学杂志.2018年12月第38卷第6期
[6]王世恩，吴红艳，王艳林，夏燕，曹春雨.CRISPR-Cas9与抗肿瘤免疫治疗的研究进展[J].生命的化学, 2018, 38(5): 702-706
[7]崔建洲，林秀金，沈汉明.基因编辑技术(CRISPR-Cas9)在医学领域的应用及其相关伦理问题思考[J].中国现代应用药学 2018 年 12 月第 35 卷第 12 期
[8]Aubrey BJ, Kelly GL, Kueh AJ, Brennan MS, O'Connor L, Milla L, Wilcox S, Tai L, Strasser A, Herold MJ. An induciblelentiviral guide RNA platform enables the identification of tumor-essential genes and tumor-promoting mutations in vivo. Cell Rep, 2015, 10(8): 14221432.
[9]姜梦圆,刘红玲.CRISPR / Cas9系统在人眼相关疾病中的应用[J].国际眼科杂志2019年2月 第19卷第2期
[10]张雪梅，高 旭，马 宁.基于CRISPR / Cas9 技术的基因敲入 /敲除策略[J].中国生物化学与分子生物学报.2019年1月10.35( 1) : 1 ～ 6
[11]徐艳崔，玉晓，杨洋，罗义，郑向群，毛大庆.CRISPR/Cas系统抵御细菌耐药[J].生态毒理学 报.2018年第13卷第3期，1-8
3. 设计方案和技术路线
实验方案：
1. 人类TF基因结构分析及靶点设计。
2. pX459-sgRNAhTF重组质粒构建及克隆。
3. pX459 － sgRNAhTF重组质粒转染、靶点效率检测及酶切验证。
4. TF 基因敲除的乳腺癌细胞株的单克隆筛选。
5. 检测 TF 敲除的乳腺癌细胞株的表达量。
6. 进行统计学分析。
技术路线分析：
针对人源TF基因sgRNA靶点的选择及寡核苷酸链设计。
利用CRISPR/Cas9系统打靶的重组载体pX459-sgRNA构建。
打靶效率的检测及酶切验证。
TF 敲除的乳腺癌细胞株的表达量的测定（PCR、western法）。
乳腺癌细胞株的鉴定
动物水平：matrigel plug实验检测肿瘤细胞增殖、血管生成 |
细胞水平：划痕实验检测迁移能力 |
4. 工作计划
近年来，CRISPR/Cas9已广泛用于各种细胞系及模式生物的研究中，并取得良好的敲除效率。但是在其应用于临床之前，我们需要进一步提高基因编辑的效率和精确度、CRISPR/Cas9系统的特异性及解决CRISPR/Cas9的潜在脱靶性问题。
本人研究进展：
5. 难点与创新点
运用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除TF,进而确立TF的表达与乳腺癌恶性的相关性。
与传统基因编辑技术相比，CRISPR作为最新一代基因编辑技术具有无法替代的优势，包括良好的特异性、可用位置更多、使用范围广、更具有可拓展性、使用方便、步骤简单、成本低廉等。
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