1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
土壤重金属污染是目前世界上污染面积最大、危害最为严重的环境问题之一。近几十年来，中国工业化及城镇化进程的不断加快，工业废弃物排放、污水灌溉等造成的土壤重金属污染也越来越严重，其中，镉是造成土壤污染面积最大、危害最严重的重金属之一。根据 2014 年4月公布的《全国土壤污染状况调查公报》，被调查的无机污染物中，镉超标率最高，为7.0%。镉不是植物生长的必需元素，而且含量很低时就能对植物产生危害，过量镉的吸收还会通过食物链的富集作用进入人体，严重威胁人类健康。资料显示，采矿冶炼排放的废气废液及含镉磷肥的大量使用，导致我国农田镉污染面积已超过1.3×104公顷，涵盖11个省市的25个地区。因此，研究镉对植物生长发育的影响、植物的耐受机制、植物吸收镉的特点以及镉在植物体内的分布特征，对在众多的植物种类、品种中筛选耐镉性植物，制定相关的栽培制度以减少对人类危害具有重要意义。
目前的研究已经对植物耐镉的机制有了初步进展，不同植物对镉的耐性不同。植物细胞主要通过络合作用来解除金属镉的毒害。例如植物可以调节体内抗氧化保护酶的活性。植物还能将进入体内的镉离子区域化，使它们分布在不同的细胞和液泡中，尤其是会把它们运输到生理活动不活跃的细胞内，以降低对细胞原生质体等的伤害。植物体内的发生的重金属螯合作用也是重要的解毒手段，植物体内的天然螯合剂金属硫蛋白（MT）、植物络合素（PC）、氨基酸等，可以与镉离子作用形成螯合物，降低土壤中镉离子的浓度，避免镉离子与细胞器的直接接触，从而降低镉的毒性。
果糖1，6-二磷酸醛缩酶（FBA）是生物体中一类重要的且普遍存在的酶。研究发现，自然界中存在两种类型的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶，Ⅰ型和Ⅱ型。该酶不仅是糖酵解代谢途径中第四步反应的关键酶，对生物体的新陈代谢至关重要，还对多种植物激素均有响应，使得植物能够维持生命的正常运转。近几年的研究表明，植物的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶（FBA）与多种胁迫具有密切联系，尤其是叶绿体定位的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶在植物非生物胁迫调控方面起着关键作用，能参与低温、高温、盐胁迫、干旱、强光、重金属等胁迫响应。Sarry等用重金属镉离子对拟南芥进行处理后，经过蛋白质双向电泳和质谱检测后发现，植物体内的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶蛋白含量明显减少。然而，关于FBA调控植物耐镉功能及其机制的研究尚无报道。
2. 研究的基本内容和问题
在本课题组前期工作基础上，结合前人研究中未解决的科学问题，本项目拟完成以下研究目标：前人研究发现，用重金属镉离子对拟南芥进行处理后，经过蛋白质双向电泳和质谱检测，植物体内的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶蛋白含量明显减少，发现该酶可特异性提高酵母的耐镉性。然而，关于FBA调控植物耐镉功能及其机制的研究尚无报道。因此，本研究拟筛选与海滨雀稗PvFBA1的真实互作蛋白，并验证两个蛋白之间存在互作真实性，为以后深入解析PvFBA1耐镉性的机制提供思路。
研究工作内容：构建海滨雀稗酵母双杂交系统的三框文库，通过酵母双杂交体系筛选与海滨雀稗PvFBA1互作蛋白，并通过萤火虫萤光素酶互补系统对互作蛋白的真实性进行验证。
拟解决的关键问题：筛选并验证后获得海滨雀稗PvFBA1的互作蛋白。
3. 研究的方法与方案
研究方法：本实验采用酵母双杂交体系在海滨雀稗的酵母核体系文库中筛选与PvFBA1的互作蛋白，并进行初步验证，获得候选的互作蛋白。然后对候选的互作蛋白通过LUC互作系统在植物体内进行再次验证其互作的真实性。
试验方案：
- 海滨雀稗cDNA三框酵母双杂交表达文库制备：以海滨雀稗‘Sea-spray’镉胁迫后不同时间段（0、3、24h）的叶片和根为材料，液氮速冻，等量混合提取RNA，用于酵母双杂交文库构建。采用步骤如下：采用Plant RNA Kit（OMIGA）提取海滨雀稗总RNA，FastTrack MAG mRNA Isolation试剂盒进行mRNA纯化；cDNA双链合成；将cDNA双链分三等份分别加三个重组接头（为防止移码）后混合并进行分离纯化；纯化的cDNA双链与pDONR/Zeocin载体进行BP重组反应、转化DH10B电转感受态细胞获得入门文库混合质粒；将入门文库混合质粒与酵母双杂交载体pGADT7（LEU，AmpR）通过LR重组反应、转化DH10B电转感受态细胞获得酵母双杂交次级文库混合质粒。
- 互作靶蛋白X的筛选：将获得的具有耐镉调控功能的PvFBA1经PCR扩增、酶切、LR重组构建到诱饵质粒pGBKT7（TRP，KanR）上，与①构建好的文库质粒采用PEG/LiAc法共转化酵母感受态细胞Y2H，混合培养后涂到SD/-Leu/-Trp/-His 3-AT平板上30℃培养，3-5天后从平板上筛到的克隆再在平板上划线培养进一步验证。根据阳性克隆的测序结果，提取阳性酵母质粒并转化，测序获得互作候选靶蛋白X的序列。
- 互作靶蛋白X的体内体外验证：采用酵母双杂交（Y2H）实验，将互作靶蛋白X的ORF框序列重新构建到pGADT7载体上，参照②的方法，pGADT7-X与pGBKT7- PvFBA1质粒共转酵母Y2H，验证其在酵母中的真实互作。
- PvFBA1和互作靶蛋白X分别经PCR扩增、酶切、连接构建到双元载体cLUC和nLUC,获得质粒cLUC- PvFBA1和x-nLUC。再将质粒cLUC- PvFBA1和x-nLUC分别转化到农杆菌EHA105菌株中，利用烟草瞬时转化验证PvFBA1和互作靶蛋白X互作的真实性。
可行性分析：指导老师掌握熟练的蛋白互作筛选和验证的各种分子生物学方法，为本研究的开展奠定了基础；草坪课题组实验室和学校公共平台具备完成该实验的全部仪器设备；实验中所采用的酵母双杂交体系是解析植物蛋白互作和调控机制的重要手段，筛选得到的互作蛋白经双分子荧光素酶互补技术进行再次验证，确保结果的真实可靠性。
4. 研究创新点
已有研究表明，果糖-1，6-二磷酸醛缩酶（FBA）家族成员在调控植物生长发育和抗逆途径中发挥重要作用，然而其耐镉功能尚不清楚，指导老师课题组前期发现了一个果糖-1，6-二磷酸醛缩酶（FBA）家族成员PvFBA1，正调控植物的耐镉性，其调控机制尚待解析。本研究在前期基础上，挖掘海滨雀稗PvFBA1互作蛋白，为解析其调控机制奠定基础，具有研究新颖性。
5. 研究计划与进展
（1）2019.6-2019.9：酵母双杂交文库的构建；
（2）2019.10-2019.12：酵母筛库和酵母双杂验证候选蛋白的互作；
（3）2020.1-2020.2：萤火虫荧光素酶系统验证蛋白互作。
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