1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
饲料被动物采食后，仅依靠自身及肠道微生物的消化还不足以将饲料中的所有组分充分利用，因此需要在饲料中添加特定的酶制剂来提高饲料消化率。因饲料种类和营养成分的差异，所添加的酶制剂种类也不尽相同。阿魏酸酯酶在近年来的研究和生产应用中越发活跃，其功能主要是断开植物原饲料如粗饲料当中的阿魏酸酯键，使得饲料结构疏松更易被畜禽所消化[1]。阿魏酸酯酶在水解植物纤维组织时，一般与纤维类降解酶协同作用，从而高效降解植物细胞壁组织[2]。因此阿魏酸酯酶在畜牧养殖行业具有较高的应用前景，特别是反刍动物养殖业，为提高饲料转化效率、改善动物生产性能提供了有效手段。
阿魏酸酯酶是羧酸酯水解酶的一个亚类，根据蛋白质序列及催化底物的差异性被分为A、B、C、D四类[3]。自1991年首次从链霉菌olivochromogenes中被表达和鉴定出来后，许多来源于不同细菌和真菌的阿魏酸酯酶被相继分离纯化[4]。真菌来源大多为霉菌等好氧真菌，如黑曲霉阿魏酸酯酶基因一般通过毕赤酵母来克隆表达[5,6]。Liu等[7]从发酵乳酸菌NRRLB-1932中克隆出一种未知的阿魏酸酯酶基因并在大肠杆菌中表达，该酶对于人工合成的酯类物质如4-硝基苯基乙酸酯表现出极强的酶活。来源于草食动物消化道内的厌氧真菌能够分泌多种高活性的植物细胞壁降解酶，其中也包括阿魏酸酯酶[8]。然而由于厌氧真菌生长条件苛刻，又对氧极不耐受，现今关于厌氧真菌阿魏酸酯酶的表达及酶学特性鉴定还很少。周皓芹等[9]从瘤胃液的真菌系中分离出了一种阿魏酸酯酶，研究发现该酶的最适温度和pH值分别是40 ℃和8.0，且有着很强的稳定性。但这种酶的具体厌氧真菌属来源却是未知的，所以研究具体厌氧真菌属来源的阿魏酸酯酶意义重大，这将有利于挖掘不同菌种来源的阿魏酸酯酶，促进该酶在生产中的广泛应用。
阿魏酸酯酶除了添加在饲料中促进瘤胃发酵外，在其他的行业也有较高应用价值[10]。在合成生物方面，可参与生产酯类及一些前体物用作药物；在食品领域，阿魏酸酯酶可释放膳食纤维中的阿魏酸提高抗氧化能力；在造纸业中，可参与原料的酶解，降低原料的聚合度[1,3]。随着对阿魏酸酯酶研究的不断加强，其应用的范围也会更加广泛。2. 研究的基本内容和问题
随着阿魏酸酯酶在畜牧养殖业、合成生物领域、制浆造纸业及功能性食品业的广泛应用，其需求量正不断加大。
现有阿魏酸酯酶的分离纯化，其菌种来源主要是细菌及一些好氧的真菌，细菌多为乳酸菌而真菌主要是曲霉菌属。
许多的研究报道瘤胃厌氧真菌能够分泌丰富的碳水化合物活性酶以及高效降解植物组织的酶复合体（纤维小体），然而这些酶被体外表达并应用于生产中的很少，特别是厌氧真菌阿魏酸酯酶基因的克隆表达研究。
3. 研究的方法与方案
本试验通过基因组学、转录组学及蛋白质组学技术对在特定底物下生长的厌氧真菌进行测序分析，从中筛选差异表达基因，最终得到一种阿魏酸酯酶基因序列。在大肠杆菌中异源表达后，使用镍柱亲和、离子交换和疏水性相互作用层析等方法对蛋白纯化后分析蛋白的酶学特性。分析阿魏酸酯酶的结构域发现，该酶除了存在酯酶功能区外，还含有一个糖苷水解酶11功能区和两个碳水化合物结合模块10。为了探究糖苷水解酶11和酯酶在催化不同底物时存在怎样的联系，试验采用了酶活性位点的定点突变技术。在确定需要突变的氨基酸位点后，设计合成相应的引物对阿魏酸酯酶基因进行突变改造，最后同样在大肠杆菌中表达纯化研究突变体的酶学性质，试验的技术路线如下图。
可行性分析：该阿魏酸酯酶来源于厌氧真菌，使用细菌的原核表达会影响酶的表达水平及酶产生后的修饰作用。本试验通过密码子的优化，从厌氧真菌的蛋白质序列出发，逆转录地推导能够在细菌中高效表达的基因序列，为该酶的正常表达提供了保障。另外本试验将在具有一定平台、方法成熟、相关仪器设备齐全的实验室开展，为该酶的成功表达提供了物质基础。
4. 研究创新点
本研究的特色在于表达的是厌氧真菌源的阿魏酸酯酶，而之前报道的阿魏酸酯酶菌种来源主要是细菌和好氧的真菌。而厌氧真菌是一种严格厌氧的真核微生物，其分泌的阿魏酸酯酶在底物降解和酶学特性上与以往的阿魏酸酯酶都存在一定的差异，其阿魏酸酯酶的区域分布及空间结构也是独特的，这种空间结构的差异也有可能使得阿魏酸酯酶的稳定性更高，酶活性更强。另外，本试验还引入了定点突变技术，突变后的阿魏酸酯酶会产生一些积极的酶学特性，而厌氧真菌有着较为丰富而独特的阿魏酸酯酶基因，如果合理地定向改造将具有极大的应用前景。
5. 研究计划与进展
2020.3.10-2020.4.01：收集相关文献和技术方法操作，熟悉整体的试验流程。
2020.4.02-2020.4.15：准备试验需要的试剂耗材，制定具体的试验计划。
2020.4.16-2020.5.01：正式开展试验，收集整理分数据，完成各项指标测定等任务。
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